From Assay Development to Novel Inhibitor Discovery: Disrupting mitochondrial RNA Editing in Trypanosomes

Reza Salavati (Supervisor) Tritryps diseases, including Human African Trypanosomiasis, Chagas disease, and Leishmaniasis, are debilitating infections caused by kinetoplastids that threaten the lives of millions of people and livestock. In these microorganisms, mitochondrial transcripts undergo a unique uridine insertion/deletion RNA modification to become translatable and functional. This RNA editing pathway is mediated by a multiprotein complex known as the “editosome”, which has features that underpin its suitability as a validated drug target, such as its essentiality for the parasite’s viability, absence in the host organism, multiple enzymes constitution, and conservation among disease-causing kinetoplastids. Unfortunately, no enzyme-specific inhibitor has been found within the entire editosome complex, and there is limited information on how the editosome components assemble to perform the editing process. This dissertation intends to identify novel small molecule inhibitors as chemical probes for the editosome and as starting points for antiparasitic drug discovery. First, I describe the development of three high-throughput, amenable fluorescence resonance energy transfer (FRET) reporter-based RNA editing assays that bypass the rate-limiting endonucleolytic cleavage step. In addition, a multiplex ribozyme-based insertion/deletion editing (RIDE) assay was introduced by modifying the reporter ribozyme sequence to simultaneously monitor U-insertion and deletion editing. These assays exhibit higher editing efficiencies in shorter incubation times and require significantly less purified editosome and 10,000-fold less ATP than the previously published full round in vitro RNA editing assay, enabling the identification of ATP-competitive inhibitors as demonstrated with α, β-methylene ATP (an ATP analog) as proof of principle. Second, I present the high-throughput screen (HTS) conducted in collaboration with Sanford Burnham Prebys to identify RNA editing inhibitors. We successfully miniaturized our FRET-based full-round RNA editing assay, replicating the complete RNA editing process. We used it to screen 100,000 compounds against purified editosomes derived from Trypanosoma brucei, identifying seven primary hits. We sourced and evaluated various analogs to enhance the inhibitory and parasiticidal effects of these primary hits. Mode of action (MOA) studies, utilizing the assays developed in the previous chapter, revealed inhibition of essential catalytic activities, including the RNA editing ligase and interactions of editosome proteins. Although the primary hits did not exhibit any growth inhibitory effect on parasites, eight analog compounds effectively killed T. brucei and/or Leishmania donovani parasites at low micromolar concentrations. Our findings introduce novel molecular scaffolds with the potential for broad antitrypanosomal effects.Third, I present the discovery of editosome inhibitors by screening a library of widely used human drugs using the RIDE assay. MOA studies of the identified hits and hit expansion efforts unveiled compounds that interfere with RNA-editosome interactions and novel ligase inhibitors with IC50 values in the low micromolar range. In vitro and in silico analysis of our novel ligase inhibitor, epigallocatechin gallate, demonstrated binding characteristics similar to ATP. Overall, the inhibitors demonstrated potent trypanocidal activity, and considering their established safety profiles in humans, they are promising candidates for drug repurposing.My work provides efficient, sensitive, HTS-amenable, fluorescent-based assays for the identification and MOA characterization of small-molecule RNA editing inhibitors. In addition, the novel molecular scaffolds discovered in this dissertation through pilot-scale and HTS screens can serve as leads for pan-kinetoplastid drug development and valuable research probes for studying the dynamic assembly/disassembly of the editosome Les maladies à trypanosomatides, y compris la trypanosomiase humaine africaine, la maladie de Chagas et la leishmaniose, sont des infections débilitantes causées par des kinétoplastides qui menacent la vie de millions de personnes et de bétail. Bien que des initiatives et des programmes récents visent à contrôler, réduire et éliminer ces maladies tropicales dites « négligées », il reste encore un besoin de nouveaux médicaments avec des profils de cibles principaux souhaitables. Chez ces parasites, les transcrits mitochondriaux subissent une modification unique d'insertion/suppression de l'uridine pour être traduites et devenir fonctionnels. Cette voie d'édition de l'ARN est médiée par un complexe multiprotéique appelé « éditosome », qui possède des caractéristiques désirables supportant son adéquation en tant que cible thérapeutique validée, telles que son importance pour la viabilité du parasite, l'absence chez l'organisme hôte, plusieurs composants enzymatiques, et la conservation parmi les kinétoplastides pathogènes. Malheureusement, dans le contexte du complexe éditosome, aucun inhibiteur enzymatique spécifique n'a été trouvé, et il y a peu d'informations sur la façon dont les composants de l'éditosome s'assemblent pour effectuer le processus d'édition. Cette thèse vise à identifier de nouveaux inhibiteurs de petites molécules comme sondes chimiques pour l'éditosome et comme points de départ pour la découverte de médicaments antiparasitaires.Tout d'abord, je décris le développement de trois essais d'édition de l'ARN basés sur des rapports de transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) adaptables à haut débit pour la suppression, l'insertion et la ligature préclivées, qui contournent l'étape limitante de clivage endonucléolytique. En modifiant la séquence du ribozyme rapporteur, l'essai d'édition multiplex basé sur le ribozyme d'insertion/suppression (RIDE) a été introduit pour surveiller simultanément l'édition d'insertion et de suppression de l'uridine. Ces essais présentent des efficacités d'édition plus élevées avec des temps d'incubation plus courts et nécessitent beaucoup moins d'éditosome purifié et 10 000 fois moins d'ATP que les essais d'édition de l'ARN in vitro complets publiés auparavant. Cela permet l'identification d'inhibiteurs compétitifs de l'ATP, comme démontré avec l'ATP α, β-méthylène (un analogue non hydrolysable de l'ATP) comme preuve de principe.Ensuite, je présente le criblage à haut débit (CHD) réalisé en collaboration avec Sanford Burnham Prebys pour identifier les inhibiteurs de l'édition de l'ARN. Nous avons réussi à miniaturiser notre essai d'édition de l'ARN complet basé sur le FRET, qui réplique le processus complet d'édition de l'ARN, et l'avons utilisé pour cribler 100 000 composés contre des éditosomes purifiés dérivés de Trypanosoma brucei, identifiant sept hits primaires. Nous avons sourcé et évalué divers analogues pour améliorer les effets inhibiteurs et parasiticides de ces hits primaires. Les études sur le mode d'action, utilisant les essais développés dans le chapitre précédent, ont révélé que ces inhibiteurs ciblent des activités catalytiques essentielles, y compris la ligase de l'édition de l'ARN et les interactions entre les protéines de l'éditosome. Bien que les hits primaires n'aient montré aucun effet inhibiteur sur la croissance des parasites, huit analogues tuent efficacement les parasites T. brucei et/ou Leishmania donovani à de faibles concentrations micromolaires. Nos résultats introduisent de nouvelles structures de basesmoléculaires avec un potentiel d'effets anti-trypanosomiase larges.Enfin, je présente la découverte d'inhibiteurs de l'éditosome par le criblage d'une bibliothèque de médicaments humains largement utilisés à l'aide de l'essai RIDE. Les études de mode d'action (MOA) des hits identifiés, ainsi que les efforts d'optimisation des hits, ont révélé des composés qui interfèrent avec les interactions ARN-éditosome et des nouveaux inhibiteurs de ligase avec des valeurs d’IC50 de l’ordre des faibles micromolaires. Les analyses in vitro et in silico de notre nouvel inhibiteur de ligase, l'épigallocatéchine gallate, ont démontré des caractéristiques de liaison similaires à celles de l'ATP. Dans l'ensemble, ces inhibiteurs ont montré une activité trypanocide puissante et, compte tenu de leurs profils de sécurité établis chez l'homme, ils sont des candidats prometteurs pour le repositionnement de médicaments.Mon travail fournit des essais efficaces basés sur la fluorescence, sensibles et adaptables au CHD pour l'identification et la caractérisation mécanistique des inhibiteurs de petites molécules de l'édition de l'ARN. De plus, les nouvelles structures de base moléculaires découvertes dans cette thèse grâce à des criblages à petite échelle et CHD peuvent servir de leads pour le développement de médicaments pan-kinétoplastides, ainsi que de sondes de recherche précieuses pour étudier l'assemblage dynamique et le désassemblage de l'éditosome