Identifying nuclear protein interactions associated with variant antigen gene expression in Trypanosoma brucei

Igor Cestari (Supervisor) Human African Trypanosomiasis (HAT) is a deadly neglected tropical disease that affects thousands of people each year in 29 endemic countries across sub-Saharan Africa. HAT is caused by a microscopic, protozoan parasite known as Trypanosoma brucei (T. brucei) which is transmitted by the bite of infected tsetse flies. Some T. brucei subspecies cause Animal Trypanosomiasis (AT) such as nagana, which affects cattle and results in large-scale agricultural economic losses. T. brucei evades the host antibody response by antigenic variation, expressing a single VSG gene from a repertoire of 2,500 different VSG genes primarily within subtelomeric regions. Previous mass-spectroscopy data found numerous highly enriched proteins associating with inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) 5-phosphatase (PIP5Pase) and Repressor Activator Protein 1 (RAP1). Key regulators of silent telomeric expression sites (ESs), that control part of VSG expression and switching. This thesis explores those enriched proteins, tagging them in transgenic bloodstream form trypanosomes using modular cloning strategies and a CRISPR/SaCas9 system. We used these cell lines to performs Immunofluorescence assays (IFA’s) to validate protein localization of Tb927.2.4980 (EMG1 methyltranferase) to previously reported findings. Further work, knocking down PIP5Pase to verify their localization changes and protein interaction could provide additional insights into trypanosome biology and VSG switching . Immunoprecipitation and mass spectrometry analyses of AP1 (Tb927.8.5510) were compared to PIP5Pase and RAP1 data, highlighting interacting proteins associated with RNAPII transcription machinery and DNA repair. Protein comparative alignments across species demonstrated the conserved regions and domains in AP1, providing insights into this replication machinery and their potential drug targets. Further research could provide additional insights into the complex network of proteins involved in transcription and VSG switching of T. brucei. La trypanosomiase humaine africaine (THA) est une maladie tropicale négligée qui s'affecte des milliers de personnes chaque année dans 29 pays endémiques à travers l'Afrique subsaharienne. THA est causée par un parasite protozoaire microscopique appelé Trypanosoma brucei (T. brucei), transmis aux humains par la pique d'une mouche tsé-tsé infectieuse. Quelques espèces de T. brucei peuvent aussi causer des maladies de tryposomose animale africaine, comme nagana qui s'affecte les gros bétails et s'entraîne les pertes économiques agriculturales. Trypanosoma brucei s'évite la réponse anticorps d'un hôte mammalien avec la stratégie de variation antigénique, en expriment un seul gène de glycoprotéine de surface variable (VSG) d'un répertoire de 2 500 gènes principalement situés dans les régions subtélomériques. Des données précédentes de spectrométrie de masse ont mis en évidence des protéines hautement enrichies associées à l'inositol-1,4,5-trisphos-phate (IP3) 5-phosphatase (PIP5Pase) et Repressor Activator Protein 1 (RAP1), des régulateurs clés des sites d'expression télomériques silencieux (ESs), qui contrôlent une partie de l'expression et du changement des VSGs. Cette thèse explore ces protéines enrichies, en les étiquetant dans des trypanosomes sanguinaires transgéniques en utilisant des stratégies de clonage modulaires et un système CRISPR/SaCas9. Nous avons utilisé ces lignées cellulaires pour effectuer des tests d'immunofluorescence (IFA) afin de valider la localisation de la protéine Tb927.2.4980 (EMG1 méthyltransférase) en lien avec les résultats précédemment rapportés. Des travaux supplémentaires, consistant à la reduction d'expression de PIP5Pase pour vérifier leurs interactions, et pourraient fournir des informations supplémentaires sur leurs associations potentielles. Des analyses d'immunopré-cipitation et de spectrométrie de masse de AP1 (Tb927.8.5510) ont été comparées aux données de PIP5Pase et RAP1, mettant en évidence des protéines interactives associées à la machinerie transcriptionnelle de RNAPII et à la réparation d'ADN. Les alignements de protéines entre espèces ont montré les régions et domaines conservés d'AP1, fournissant des informations sur cette machinerie de réplication et leurs cibles therapeutiques potentielles. Des recherches supplémentaires pourraient apporter de nouvelles perspectives sur le réseau complexe de protéines impliquées dans la transcription et le changement des VSGs en T. brucei. Human African Trypanosomiasis (HAT) is a deadly neglected tropical disease that affects thousands of people each year in 29 endemic countries across sub-Saharan Africa. HAT is caused by a microscopic, protozoan parasite known as Trypanosoma brucei (T. brucei) which is transmitted by the bite of infected tsetse flies. Some T. brucei subspecies cause Animal Trypanosomiasis (AT) such as nagana, which affects cattle and results in large-scale agricultural economic losses. T. brucei evades the host antibody response by antigenic variation, expressing a single VSG gene from a repertoire of 2,500 different VSG genes primarily within subtelomeric regions. Previous mass-spectroscopy data found numerous highly enriched proteins associating with inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) 5-phosphatase (PIP5Pase) and Repressor Activator Protein 1 (RAP1). Key regulators of silent telomeric expression sites (ESs), that control part of VSG expression and switching. This thesis explores those enriched proteins, tagging them in transgenic bloodstream form trypanosomes using modular cloning strategies and a CRISPR/SaCas9 system. We used these cell lines to performs Immunofluorescence assays (IFA’s) to validate protein localization of Tb927.2.4980 (EMG1 methyltranferase) to previously reported findings. Further work, knocking down PIP5Pase to verify their localization changes and protein interaction could provide additional insights into trypanosome biology and VSG switching . Immunoprecipitation and mass spectrometry analyses of AP1 (Tb927.8.5510) were compared to PIP5Pase and RAP1 data, highlighting interacting proteins associated with RNAPII transcription machinery and DNA repair. Protein comparative alignments across species demonstrated the conserved regions and domains in AP1, providing insights into this replication machinery and their potential drug targets. Further research could provide additional insights into the complex network of proteins involved in transcription and VSG switching of T. brucei. La trypanosomiase humaine africaine (THA) est une maladie tropicale négligée qui s'affecte des milliers de personnes chaque année dans 29 pays endémiques à travers l'Afrique subsaharienne. THA est causée par un parasite protozoaire microscopique appelé Trypanosoma brucei (T. brucei), transmis aux humains par la pique d'une mouche tsé-tsé infectieuse. Quelques espèces de T. brucei peuvent aussi causer des maladies de tryposomose animale africaine, comme nagana qui s'affecte les gros bétails et s'entraîne les pertes économiques agriculturales. Trypanosoma brucei s'évite la réponse anticorps d'un hôte mammalien avec la stratégie de variation antigénique, en expriment un seul gène de glycoprotéine de surface variable (VSG) d'un répertoire de 2 500 gènes principalement situés dans les régions subtélomériques. Des données précédentes de spectrométrie de masse ont mis en évidence des protéines hautement enrichies associées à l'inositol-1,4,5-trisphos-phate (IP3) 5-phosphatase (PIP5Pase) et Repressor Activator Protein 1 (RAP1), des régulateurs clés des sites d'expression télomériques silencieux (ESs), qui contrôlent une partie de l'expression et du changement des VSGs. Cette thèse explore ces protéines enrichies, en les étiquetant dans des trypanosomes sanguinaires transgéniques en utilisant des stratégies de clonage modulaires et un système CRISPR/SaCas9. Nous avons utilisé ces lignées cellulaires pour effectuer des tests d'immunofluorescence (IFA) afin de valider la localisation de la protéine Tb927.2.4980 (EMG1 méthyltransférase) en lien avec les résultats précédemment rapportés. Des travaux supplémentaires, consistant à la reduction d'expression de PIP5Pase pour vérifier leurs interactions, et pourraient fournir des informations supplémentaires sur leurs associations potentielles. Des analyses d'immunopré-cipitation et de spectrométrie de masse de AP1 (Tb927.8.5510) ont été comparées aux données de PIP5Pase et RAP1, mettant en évidence des protéines interactives associées à la machinerie transcriptionnelle de RNAPII et à la réparation d'ADN. Les alignements de protéines entre espèces ont montré les régions et domaines conservés d'AP1, fournissant des informations sur cette machinerie de réplication et leurs cibles therapeutiques potentielles. Des recherches supplémentaires pourraient apporter de nouvelles perspectives sur le réseau complexe de protéines impliquées dans la transcription et le changement des VSGs en T. brucei.