Functional characterization of insecticide resistance mechanisms in agricultural pests and vectors of diseases using CRISPR/Cas9 genome modifications

Ο έλεγχος των πληθυσμών αρθροπόδων, τόσο φορέων ασθενειών όσο και εχθρών καλλιεργειών, αποτελεί μια διαρκή πρόκληση καθώς οι συνεχείς ανάγκες για τον περιορισμό των δυσμενών επιπτώσεών τους στη δημόσια υγεία όσο και τη γεωργία απαιτούν την εφαρμογή βιώσιμων και αποτελεσματικών στρατηγικών ελέγχου. Η χημική καταπολέμηση όπου γίνεται χρήση εντομοκτόνων αποτελεί την κυριότερη και συχνότερα εφαρμοζόμενη μέθοδο. Ωστόσο, η εμφάνιση και εξάπλωση του φαινομένου της ανθεκτικότητας, ως αποτέλεσμα της εκτεταμένης χρήσης εντομοκτόνων, απειλεί την αποτελεσματικότητα των υφιστάμενων παρεμβάσεων. Η καλύτερη κατανόηση των μοριακών παραγόντων που καθορίζουν τόσο την εντομοκτόνο δράση όσο και την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας είναι σημαντική για τη διατήρηση της αποτελεσματικότητας της χημικής καταπολέμησης. Μάλιστα, η ανακάλυψη του συστήματος CRISPR/Cas9 ως εργαλείο γενετικών τροποποιήσεων, διεύρυνε τις δυνατότητες μελέτης του ρόλου γονιδίων που εμπλέκονται στην τοξική δράση των εντομοκτόνων αλλά και της λειτουργικής ανάλυσης των μοριακών μηχανισμών ανθεκτικότητας. Στα κεφάλαια 1 και 2, επίκεντρο της μελέτης μου αποτέλεσαν δύο είδη κουνουπιών υγειονομικής σημασίας, Anopheles funestus και Anopheles gambiae, τα οποία συγκαταλέγονται μεταξύ των κύριων φορέων της ελονοσίας στην Αφρική. Στο κεφάλαιο 1, αναπτύχθηκε ένα βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο στοχευμένων γενετικών τροποποιήσεων στο An. funestus κάνοντας χρήση του συστήματος CRISPR/Cas9 αξιοποιώντας το μονοπάτι επιδιόρθωσης βλαβών μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Στην εργασία αυτή, καταγράφεται η πρώτη επιτυχής εφαρμογή του καλύπτοντας ένα σημαντικό μεθοδολογικό κενό για αυτό το είδος κουνουπιού. Έτσι, θέτει τις βάσεις για μελλοντικές μελέτες για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό γονιδίων αλλά και μεταλλαγών που θα συμβάλλουν στην καλύτερη κατανόηση της βιολογίας, της φυσιολογίας αλλά και των μηχανισμούς τοξικής δράσης και ανθεκτικότητας εντομοκτόνων ουσιών στον οργανισμό αυτό. Επιπλέον, τα υψηλά ποσοστά γενετικού μετασχηματισμού (transformation) που επιτεύχθηκαν υποδηλώνουν την καταλληλόλητα της μεθοδολογίας αυτής για την ανάπτυξη καινοτόμων μεθόδων καταπολέμησης του, όπως gene drives. Στο κεφάλαιο 2, στόχος ήταν να εκτιμηθεί στο κουνούπι An.gambiae η συνεισφορά ενός μηχανισμού ανθεκτικότητας στόχου έναντι των πυρεθροειδών που αναδείχθηκε από πρόσφατη γονιδιωματική ανάλυση ανθεκτικών ατόμων αυτού του είδους. Συγκεκριμένα, επιλέχθηκε ο απλότυπος όπου συνυπάρχουν οι μεταλλαγές, V402L και I1527T, στο γονίδιο-στόχο των πυρεθροειδών που κωδικοποιεί το κανάλι νατρίου. Για το σκοπό αυτό, αξιοποιήθηκε το διαθέσιμο γενετικά τροποποιημένο στέλεχος που φέρει σε ομοζυγωτία την μεταλλαγή V402L (στέλεχος Kisumu-V402L/L απο προηγούμενη σχετική μελέτη) και το σύστημα CRISPR/Cas9 για την στοχευμένη εισαγωγή της μεταλλαγής Ι1527Τ για τη δημιουργία του στελέχους που θα φέρει και τις δύο αυτές μεταλλαγές σε ομοζυγωτία (402L/L; 1527T/T. Όμως, σε ομοζυγωτία ο γονότυπος αυτός ανιχνεύθηκε μόνο σε προνύμφες πρώιμου σταδίου, ενώ δεν εντοπίστηκαν ποτέ βιώσιμα ενήλικα άτομα. Η παρατηρηθείσα θνησιμότητα υποδηλώνει ότι συγκεκριμένος γονότυπος συνδέεται με σημαντικό κόστος προσαρμοστικότητας. Επιπλέον, βιοδοκιμές με δελταμεθρίνη σε άτομα που έφεραν τη μεταλλαγή I1527T σε ετεροζυγωτία, σε γενετικό υπόβαθρο ομόζυγο για τη V402L, δεν ανέδειξαν στατιστικά σημαντική αύξηση της ανθεκτικότητας σε σύγκριση με το πατρικό στέλεχος Kisumu-V402L/L. Τα αποτελέσματα αυτά, υποδηλώνουν ότι η παρουσία ενός μόνο αλληλομόρφου που φέρει τη μεταλλαγή Ι1527Τ συνδυαστικά με την μεταλλαγή V402L σε ομοζυγωτία δεν φάνηκε να προσδίδει ανιχνεύσιμη πρόσθετη αύξηση των επιπέδων ανθεκτικότητας στην δελταμεθρίνη υπό τις συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες. Ωστόσο, η αδυναμία δημιουργίας αμιγούς ομόζυγου στελέχους λόγω της πρώιμης θνησιμότητας περιόρισε τις δυνατότητες για την φαινοτυπική αξιολόγηση του συνδυαστικού αυτού γονοτύπου. Στα δύο επόμενα κεφάλαια, η έρευνά μου επικεντρώθηκε στο λεπιδόπτερο Spodoptera frugiperda, ένα έντομο εχθρό καλλιεργειών με παγκόσμια εξάπλωση, που πρόσφατα εντοπίστηκε και στην Ελλάδα. Πιο συγκεκριμένα, εστίασα στην ευρέως διαδεδομένη μέθοδο καταπολέμησής του με τη χρήση εντομοκτόνων πρωτεϊνών (τοξινών) από το βάκιλο Bacillus thuringiensis (Bt). Στόχος του κεφαλαίου 3, ήταν η in vivo αξιολόγηση στο Sp.frugiperda της συμβολής στην ανθεκτικότητας έναντι της τοξίνης Cry1F των μεταλλάξεων που εντοπίζονται στον εξωκυττάριο βρόχο 4 της πρωτεΐνης-μεταφορέα ABCC2. Για τη δημιουργία του γενετικά τροποποιημένου στελέχους που θα φέρει τις μεταλλαγές αυτές, χρησιμοποίησα το σύστημα CRISPR/Cas9, στοχεύοντας το μονοπάτι επιδιόρθωσης μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Ωστόσο, παρά τις εκτενείς προσπάθειες και τα διάφορα εναλλακτικά σχέδια πειραματικής υλοποίησης που δοκιμάστηκαν, δεν κατέστη δυνατή η δημιουργία του επιθυμητού στελέχους. Ο χαμηλός ρυθμός μεταλλαξιγέννεσης μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού στα G0 άτομα εκτιμήθηκε χαμηλότερα από 1%. Το ποσοστό αυτό λειτούργησε ανασταλτικά στον εντοπισμό και διαλογή των επιθυμητών γενετικά τροποποιημένων, βιώσιμών και γόνιμων απογόνων, παρεμποδίζοντας την ανάκτηση και κληροδότηση του επιθυμητού αλληλομόρφου στις ακόλουθες γενιές και, κατά συνέπεια, τη δημιουργία του επιθυμητού ομόζυγου γενετικά τροποποιημένου στελέχους. Στο κεφάλαιο 4, διερεύνησα εάν το γονίδιο της τετρασπανίνης SfTspC5a, ομόλογο του HaTspC5 (γνωστό και ως HaTSPAN1) το οποίο έχει βρεθεί να εμπλέκεται στο μονοπάτι τοξικότητας της τοξίνης Cry1Ac στο λεπιδόπτερο Helicoverpa armigera, εμπλέκεται επίσης στο μονοπάτι της τοξικής δράσης της Cry1Ac στο Sp.frugiperda. Δημιουργήθηκε επιτυχώς ένα ομόζυγο γενετικά τροποποιημένο στέλεχος στο οποίο πραγματοποιήθηκε στοχευμένη αδρανοποίηση του γονιδίου αυτού (knockout) εφαρμόζοντας το σύστημα CRISPR/Cas9 μέσω του μη-ομόλογου ανασυνδυασμού μονοπατιού επιδιόρθωσης. Βιοδοκιμές έναντι της τοξίνης Cry1Ac έδειξαν μειωμένη ευαισθησία του στελέχους αυτού, υποδηλώνοντας για πρώτη φορά τη συμμετοχή της πρωτεΐνης SfTspC5a στο μονοπάτι τοξικότητας της Cry1Ac στο Sp.frugiperda.