In silico structural and functional analysis of «Trypanosoma brucei» RNA editing ligases and their interaction with their binding partner proteins

Purisima, Enrico (Supervisor2) Reza Salavati (Supervisor1) Trypanosomatids are the causative agents of African sleeping sickness, Chagas disease and leishmaniasis in Africa and South America. Mitochondrion of trypanosomatids undergoes extensive remodelling during the life cycle of the parasites. This is due to a mechanism so-called RNA editing which alters the mitochondrial mRNA transcripts to finally produce functional proteins. A multiprotein complex catalyzes RNA editing, so-called the editosome, which consists of more than 20 known proteins that are essential for the survival of the parasites. RNA editing starts with an endonucleolytic cleavage at the editing site, followed by uridine insertion by terminal uridylyl transferase or deletion by exonuclease and ligation of the edited site by two RNA ligases. RNA editing ligases 1 and 2 are found to be in deletion and insertion pathways, respectively.Nevertheless, the conformational switches, the structural details and the mechanism of interaction with binding partner proteins remained elusive. This thesis takes advantage of the protein modeling, simulation and analysis to provide novel details of RNA editing ligases structure and function at the molecular level.Chapter one reviews the current literature of the field and gives an introduction to the parasite of interest, Trypanosoma brucei, as well as RNA editing and particularly RNA ligation. In addition, it browses the research question regarding the structural and molecular details of RNA editing ligases.Chapter two discusses about the physical-chemical differences reported for the first time on RNA editing ligases. For this purpose, we modeled the three dimensional structure of RNA editing ligase 2 that was not reported in the literature previously. Using titration charts, we found out that there is an acid-base complementarity among the proteins in insertion and deletion pathways (sequence level). We then found that the 3D coordinates of RNA editing ligases show different electrostatic properties (structure level). We determined the RNA recognition motifs as well as protein-protein interaction areas on the surfaces of both ligases. Chapter three presents molecular dynamics simulations of RNA editing ligases 1 and 2 in complex with their double stranded RNA substrate. We performed three replicates of 40-ns simulation to investigate the dynamics of those complexes at molecular level. We showed that magnesium ion coordinates the two ends of interacting to-be-sealed RNA. In addition, magnesium ion lowers the pKa of the nucleophile side chain, thereby activating it for the reaction. We also calculated the solvated interacting energy of holoenzymes on one side and the nucleic acid and magnesium ion on the other side. We found that the calculated binding free energy is lower when the terminal nucleotide is changed from cytosine to guanine. This observation agreed well with the experiments carried out for the ligases activity.Finally, chapter four presents the assembly of interacting partner with RNA editing ligase 2 in complex with the nucleic acid. For the first time, we found how previously reported arginine on the surface of OB-fold interacts with the nicked nucleotide, consistent with the observation of the laboratory report. These studies led to characterization of the RNA editing ligases in silico. Since the mechanism of RNA editing is unique in trypanosomatid pathogens, this thesis contributes to design the possible drug molecules against these parasites. Le trypanosomatide est l’agent pathogène responsable de la maladie du sommeil, de la maladie de chagas et de la leischmaniose en Afrique et en Amérique du Sud. L’expression du génome mitochondrial chez le trypanosomatide exige une vaste modification post-transcriptionnelle, appelée édition de l’ARN, qui modifie les transcrits traduisibles produisant les facteurs essentiels du complexe de chaîne respiratoire du parasite. Cependant, la dynamique, les détails structurels et le mécanisme d’interaction des ligases avec l’ARN ou leurs protéines partenaires ne sont pas encore bien étudiés. Cette thèse utilise la modélisation moléculaire et la dynamique moléculaire simulée des protéines, ainsi que leur analyse, afin de fournir de nouveaux détails par rapport à la structure des ligases de l’ARN et à leur fonction au niveau moléculaire.Le premier chapitre compile la littérature reliée au sujet et introduit le parasite d’intérêt, Trypanosoma brucei, ainsi que le mécanisme d’édition de l’ARN et le processus de ligation en particulier. De plus, il pose la problématique de recherche portant sur les aspects structurels et moléculaires des enzymes de ligation de l’ARN.Le deuxième chapitre discute les différences physico-chimiques entre les deux enzymes de ligation (REL1 et REL2), résultats rapportés pour la première fois. À cet effet, j’ai modélisé la structure tridimensionnelle de la ligase de l’ARN 2 (REL2), ce qui n’avait pas été rapporté dans la littérature auparavant. En utilisant des courbes de titrage, j’ai mis en évidence une complémentarité acide-base entre les protéines impliquées dans les voies d’insertion et de délétion (au niveau de la séquence primaire de la protéine). Ensuite, j’ai identifié des propriétés électrostatiques différentes au niveau de la structure tridimensionnelle des ligases de l’ARN. Les motifs de reconnaissance de l’ARN et les régions d’interaction protéine-protéine ont été aussi distingués.Le troisième chapitre présente la dynamique moléculaire simulée du complexe comprenant chaque enzyme de ligation de l’ARN 1 ou 2 avec l’ARN double brin comme substrat. J’ai effectué des simulations de 40 nanosecondes en triplicata dans le but de comprendre la dynamique de ces complexes au niveau moléculaire. Je montre que l’ion magnésium coordonne les deux extrémités de l’ARN devant être soumises à la ligation. En plus, l’ion magnésium diminue le pKa de la chaîne latérale nucléophile, lui permettant de s’activer pour déclencher la réaction d’adénylation. J’ai aussi calculé l’énergie de solvatation libérée lors de l’interaction (solvated interacting energy) entre les holoenzymes d’une part et l’acide nucléique et le magnésium d’autre part. Ces résultats ont montré que l’énergie libre de liaison est inférieure lorsque le nucléotide terminal cytosine est remplacé par une guanine. Cette dernière observation est tout à fait en accord avec les données sur l’activité des ligases au laboratoire. Finalement, le quatrième chapitre décrit les données obtenues lors de l’assemblage de la ligase de l’ARN 2 avec son partenaire d’interaction, KREPA1, et l’acide nucléique. Nous avons compris pour la première fois comment le résidu arginine, déjà décrit sur la surface du domaine de liaison OB, interagit avec le nucléotide de coupure simple brin. Ces observations sont compatibles avec les données du laboratoire.Les résultats obtenus grâce à ces recherches permettent la caractérisation in silico de ligases de l’édition des ARN. Etant donné que le mécanisme de l’édition des ARN est unique au pathogène trypanosomatide, cette thèse contribue à la découverte de possibles molécules médicamenteuses contre ce parasite.